LightSheet Add-On – Lernpfad

Status: Skeleton. Quelle: lightsheet.md. Voraussetzung: CoreBox + Electronics + Infinity + Fluorescence (Laser) + Raspberry-Pi-Kit.

Das LightSheet Add-On erweitert das System um das openSPIM-inspirierte Konzept: Ein Laserstrahl wird über eine Zylinderlinse zu einem dünnen Lichtblatt geformt, das die Probe orthogonal zur Detektion beleuchtet. Damit sind sanfte 3D-Aufnahmen lebender Proben (z. B. Zebrafisch-Embryos) möglich.

Lernpfad

Was ist ein Lichtblatt? ─► Zylinderlinse verstehen ─► Lichtblatt aufbauen & ausrichten
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                       Probenkammer befüllen ─► Orthogonale Detektion ─► Z-Stack & 3D-Rekonstruktion

Experimente

1. Lichtblatt – das Prinzip

Einstieg / Phänomen

• Was siehst du, wenn du mit einer Taschenlampe ein Aquarium von der Seite beleuchtest – erkennst du eine Schicht?
• Wie unterscheidet sich das Epifluoreszenz-Bild einer 3D-Probe von einem Lichtblatt-Bild?

Physikalischer Hintergrund

• Warum reduziert die selektive Beleuchtung die Phototoxizität im Vergleich zur Epifluoreszenz um einen Faktor 10–100?
• Was bedeutet „optische Sektionierung", und wie hängt die Schnittdicke von Lichtblattdicke und Detektions-NA ab?

Alltagsbezug / Forschung

• Wie wird SPIM (Selective Plane Illumination Microscopy) genutzt, um ganze Zebrafisch-Embryos lebend abzubilden?
• Wo wird Lichtblatt-Mikroskopie kommerziell eingesetzt (Zeiss Lightsheet Z.1, Leica THUNDER)?

Variation

• Vergleiche: Was zeigt eine einzelne Z-Ebene im Epifluoreszenz-Modus vs. im Lichtblatt-Modus?

Differenzierung

• Sek I / Einstieg: Erkläre das Prinzip mit einer Laserpointer-Demonstration in einem Milch-Wasserglas.

• Sek II / Vertiefung: Leite die Lichtblattdicke aus der Gaussian-Beam-Optik (Rayleigh-Länge, Waist) her.

• → experiments/01_lichtblatt_prinzip.md

2. Zylinderlinse – aus Strahl wird Blatt

Einstieg / Phänomen

• Halte die Zylinderlinse vor eine Lichtquelle und drehe sie: Was siehst du auf dem Schirm?
• Was passiert, wenn du eine sphärische Linse verwendest – bekommst du auch ein Blatt?

Aufbau

• Wie setzt du die justierbare Zylinderlinse in den Cube ein, und nach welchem Kriterium richtest du sie aus?
• Welche Achse der Linse fokussiert, und warum bleibt die andere Achse kollimiert?

Messung / Quantifizierung

• Wie dünn ist das Lichtblatt am Fokuspunkt (Waist)? Miss es auf einem Schirm.
• Wie weit erstreckt sich die nutzbare Zone des Blatts (Rayleigh-Länge $z_R = \pi w_0^2 / \lambda$)?

Variation

• Wie ändert sich die Blattdicke, wenn du die Zylinderlinse gegen eine mit kürzerer Brennweite tauschst?
• Was siehst du, wenn du die Zylinderlinse um 90° rotierst?

Fehleranalyse

• Was tust du, wenn das Blatt nicht symmetrisch ist (eine Seite dicker als die andere)?

Physikalischer Hintergrund

• Erkläre astigmatische Fokussierung und warum der Gaussian-Beam-Waist in nur einer Raumdimension entsteht.

• → experiments/02_zylinderlinse.md

3. Lichtblatt aufbauen & ausrichten

Einstieg / Phänomen

• Was siehst du auf der Justage-Kamera, bevor das Lichtblatt richtig ausgerichtet ist?
• Wie erkennst du, dass Beleuchtungs- und Detektionsachse wirklich senkrecht stehen?

Aufbau / Justage-Workflow

• Welche Reihenfolge empfiehlt sich: Zylinderlinse, Spiegel, Objektiv, Kammer?
• Wie nutzt du die Justage-Kamera, um das Blatt in der Detektionsebene zu positionieren?

Messung / Qualitätskontrolle

• Welche Kriterien prüfst du: Blattdicke am Zentrum, Blattdicke am Rand, Verkippung, Lateralversatz?
• Wie misst du die Lichtblattdicke aus dem Kamerabild (Gaussian-Fit an Intensitätsprofil)?

Variation

• Was ändert sich im Fluoreszenz-Bild, wenn du das Lichtblatt um 5° verkippt ist?
• Wie justierst du nach, wenn das Lichtblatt nach einer Stunde thermal driftet?

Fehleranalyse

• Was tust du, wenn das Lichtblatt unsymmetrisch erscheint (Dejustage der Zylinderlinse)?
• Wie erkennst du, dass Reflexionen der Probenkammer störende Streifenmuster erzeugen?

Alltagsbezug

• Wie lösen kommerzielle Systeme das Ausrichtungsproblem (motorisierte Achsen, automatische Kalibrierung)?

• → experiments/03_lichtblatt_justage.md

4. Probenkammer und Probenmontage

Einstieg / Phänomen

• Was siehst du, wenn du die Kammer nicht vollständig entlüftest – welche Artefakte entstehen durch Luftblasen?
• Warum muss die Probe im Medium (Wasser, Agarose) hängen statt auf einem Objektträger zu liegen?

Aufbau

• Wie befüllst du die Kammer Blasen-frei (langsam von unten, Schräghalten)?
• Wie bereitest du eine Agarose-Probe vor: Konzentration, Einbettungsprotokoll, Spritzen-Halter?

Messung

• Wie kontrollierst du, ob der Brechungsindex der Einbettmediums zur verwendeten Optik passt?
• Wie findest du die Probe in der Kammer – zuerst im Durchlicht (NeoPixel) dann in Fluoreszenz?

Variation

• Wie ändert sich das Bild bei verschiedenen Agarose-Konzentrationen (0.5 %, 1 %, 2 %)?
• Was passiert, wenn du die Probe aus der Kammer herausragt (Randeffekte)?

Fehleranalyse

• Was tust du, wenn die Probe sich im Lichtblatt dreht (Konvektion, Agarose zu weich)?

Physikalischer Hintergrund

• Warum führt Brechungsindex-Mismatch zu Aberrationen und verminderter Lichtblattqualität tief im Gewebe?

• → experiments/04_probenkammer.md

5. Orthogonale Detektion

Einstieg / Phänomen

• Was würde passieren, wenn Detektion und Beleuchtung in dieselbe Richtung zeigten – warum verlieren wir den Schicht-Kontrast?
• Wie erkennst du im Bild, dass wirklich nur die beleuchtete Ebene sichtbar ist?

Aufbau

• Wie überprüfst du mit einem Winkelmesser, dass Detektionsobjektiv und Lichtblatt-Achse tatsächlich 90° bilden?
• Wo sitzt der Emissionsfilter im Detektionspfad, und wie sicherst du ihn?

Messung / Quantifizierung

• Miss die axiale Schnittdicke: Scan eine fluoreszierende Kugel (Bead) durch das Lichtblatt und bestimme die FWHM.
• Vergleiche den Signalabfall mit und ohne Emissionsfilter.

Variation

• Was siehst du im Bild, wenn du den Detektionspfad geringfügig verkippt (nicht exakt 90°)?
• Wie ändert sich der Out-of-Focus-Hintergrund, wenn du die Lichtblattdicke verdoppelst?

Physikalischer Hintergrund

• Wie beschreibt der optische Übertragungsterm die axiale Auflösung: $\Delta z \approx \lambda_\text{em} / \text{NA}_\text{det}^2$ (Beugungslimit)?

Alltagsbezug

• Welche medizinischen Bildgebungsverfahren nutzen orthogonale Geometrien (OCT, Lichtblatt-Endoskopie)?

• → experiments/05_orthogonale_detektion.md

6. Z-Stack und 3D-Rekonstruktion

Einstieg / Phänomen

• Wie sieht eine einzelne Z-Ebene aus, und was fehlt, bis du das 3D-Volumen erkennst?
• Was bedeutet Nyquist-Abtastrate hier: Wie fein muss der Z-Schritt im Vergleich zur Lichtblattdicke sein?

Aufbau / Software

• Wie konfigurierst du den Scan-Loop in ImSwitch: Starttposition, Endposition, Schrittweite, Trigger?
• Welches Format speichert du den Stack (OME-TIFF, HDF5 / Zarr) für spätere Analyse?

Messung / Quantifizierung

• Wie viele Ebenen brauchst du, um ein 500-µm-Volumen Nyquist-korrekt abzutasten (Lichtblattdicke = 5 µm)?
• Wie lange dauert der Scan, und was bestimmt die Geschwindigkeit (Kamera-Framerate, Motor-Speed, Fluoreszenz-Intensität)?

Visualisierung

• Wie erstellst du eine Maximum-Intensity-Projection (MIP) in Fiji?
• Wie visualisierst du das Volumen 3D in napari oder Fiji 3D Viewer?

Fehleranalyse

• Was tust du, wenn der Stack Streifen-Artefakte zeigt (Schattenstreifen durch Streuer im Lichtblatt)?
• Wie kompensierst du Drift zwischen dem ersten und letzten Bild des Stacks?

Alltagsbezug / Erweiterung

• Wie nutzt die moderne Entwicklungsbiologie Lichtblatt-Stacks für Cell-Tracking in Zebrafisch-Embryos?

• → experiments/06_zstack_3d.md

7. NeoPixel-Durchlicht für Übersicht

Einstieg / Phänomen

• Was siehst du im Durchlicht-Modus mit den NeoPixel-LEDs im Vergleich zum Fluoreszenz-Modus?
• Warum ist das Hellfeld-Übersichtsbild nützlich, bevor du zum Fluoreszenz-Scan wechselst?

Aufbau

• Wie adressierst du die NeoPixel-LEDs über das ESP32-Board für weiße Beleuchtung?
• Wie schaltest du zwischen Durchlicht und Fluoreszenz-Beleuchtung um, ohne die Probe zu bewegen?

Messung

• Wie nutzt du das Durchlichtbild, um die Probe zu navigieren und einen Interessensbereich (ROI) zu finden?
• Wie vergleichst du Durchlicht- und Fluoreszenz-Bild derselben Ebene (Overlay, Colourierung)?

Variation

• Welche Farbe der NeoPixel-LEDs eignet sich für welche Probe (weißes Licht vs. grünes vs. rotes)?

Fehleranalyse

• Was tust du, wenn die NeoPixel-LEDs unterschiedlich hell leuchten (Kalibration)?

Physikalischer Hintergrund

• Warum zeigt das Durchlichtbild einer transparenten Probe kaum Kontrast, während Phasenkontrast oder DPC hier helfen würden?

Alltagsbezug

• Wie nutzen multimodale Mikroskope (Durchlicht + Fluoreszenz) die Möglichkeit, Zellen gleichzeitig morphologisch und molekular zu charakterisieren?

• → experiments/07_neopixel_uebersicht.md

Cube-Module / Komponenten

Modul	Kurzbeschreibung	Datei
Zylinderlinse 100 mm (justierbar)	Lichtblatt-Erzeugung	modules/cylinder_lens_100.md
Probenkammer (wassergefüllt, NeoPixel)	Probenhalter inkl. Durchlicht-LED	modules/sample_chamber.md
Mikrometer-XYZ-Stage	Probenpositionierung, Spritzen-Halter	modules/xyz_micrometer_stage.md
Emissionsfilter (steckbar)	Spektrale Trennung	modules/em_filter_removable.md
Justage-Kamera	Hilfe bei Ausrichtung	modules/alignment_camera.md
Solid Baseplate 10 mm POM, 4×5	Stabile mechanische Basis	modules/solid_baseplate_4x5.md

Didaktische Anker

• Konkretes Beispiel für moderne biologische Bildgebung.
• Konzept „orthogonale Geometrie" als didaktisches Highlight.
• 3D-Daten als Brücke zu Bildverarbeitung / Informatik.

Offene Fragen / TODO

• Beispiel-Probenprotokoll (Zebrafisch, fluoreszente Mikrosphären).
• Schritt-für-Schritt-ImSwitch-Konfiguration.
• Sicherheits- und Wassermanagement-Hinweise.